猪胚胎干细胞的分离克隆

李晓梅  曾养志  云南农业大学动物科学与技术学院（昆明650201）

摘要  本文从分化抑制物、培养基的选择、内细胞团的分离、胚胎干细胞的分离及鉴定方法等方面系统地阐述了猪胚胎干细胞分离克隆的研究进展，并对其未来的应用前景进行展望。

关键词  猪  胚胎干细胞  分离  克隆

    胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES）是从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离得来的一种全能性或多能性细胞；而另一种具有全能性或多能性的细胞是从胚胎的原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）分离得来的胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells,EG）。

    1981年，英国剑桥大学的Evans和Karfman从小鼠囊胚期的内细胞团获取细胞，首先建成ES细胞系，从此进入了胚胎干细胞培养建系的新纪元。此后，人们建立了许多动物的ES细胞系。 1990年，Evans,Strojek及 Piedrahita各自成功地建立了猪类ES细胞系。1992年，Matsui等用小鼠原始生殖细胞首先建成EG细胞系，又开创了一种新的建立全能性（或多能性）细胞系的材料。1994年，Robert用牛原始生殖细胞建成EG细胞系，证明了原始生殖细胞可以作为建立全能性（或多能性）细胞系的新型材料。1997年，Shim用猪原始生殖细胞建成EG细胞系。但是，目前对猪全能性（或多能性）细胞系的研究，仍集中在ES细胞系的建立及传代问题上。

    猪是人类的一种重要动物蛋白质、脂类食物来源，猪的产量和质量，直接影响我国人民的生活质量。猪ES细胞系与EG细胞系的建立不仅可以促进养猪业的发展，同时可用其制作转基因动物、基因敲除动物及嵌合体动物等，为医学研究提供实验动物模型，并可进行细胞分化与胚胎发育机理的研究以及各种基因功能分析。猪与人在解剖、生理等方面十分相似，大小和体重也和人类相差不大，若能利用猪ES或EG细胞通过基因打靶，制作抗原缺陷型猪，即可将其作为异种器官移植的供体动物，这无疑是解决临床上器官不足问题的有效途径。

    本文从分化抑制物、培养基的选择、内细胞团的分离、胚胎干细胞的分离及鉴定方法等方面对猪胚胎干细胞分离克隆的研究进展作一综述。

1  分化抑制物

    胚胎干细胞在离体培养过程中易于发生自发分化，只有在培养过程中利用分化抑制物有效地抑制其分化，才有可能建成胚胎干细胞系。目前常用的分化抑制物有3种：饲养层（Feeder layer）、条件培养基（Conditioned medium，CM）和分化抑制因子（Differentiation  inhibitory ac－tivity，DIA）。在分离培养ES细胞过程中，常将饲养层与分化抑制物联合使用，而条件培养基的应用则相对较少。也有报道说，在基础培养基DMEM中添加分化抑制因子比应用饲养层及条件培养基更适于保持ES细胞的末分化状态。

1．1  饲养层

    饲养层是用特定的细胞制成的细胞单层，制作饲养层所用的细胞类型不同，分离培养ES细胞的效果也不同。分离培养鼠、兔等的ES细胞常用的饲养层细胞是STO和原代小鼠服胎儿成纤维细胞（Primary murine embryonic fibroblasts，PMEF）。对于猪ES细胞的分离培养，STO是目前发现的唯一有效的饲养层细胞。Piedrahita等用多种类型的细胞制作饲养层，研究以不同类型细胞制作的饲养层对建立猪ES细胞系的影响，结果表明只有以STO为饲养层才能分离克隆成功。虽然用猪胚胎成纤维细胞（Porcine embryonic fibroblasts，PEF）作为饲养层细胞也可以抑制猪胚胎内细胞团的分化，但其同时也抑制它的生长、繁殖。因此，在猪ES细胞的分高培养中普遍应用的也是STO。STO是一种成系的小鼠胎儿成纤维细胞，用STO制作饲养层一般需经丝裂霉素-C或γ射线灭活处理。饲养层在ES细胞的分离过程中具有促进全能性（或多能性）细胞的增殖和抑制其分化两方面的作用。促增殖作用主要是由于饲养层细胞能分泌成纤维细胞生长因子（Fi-broblast growth factor,FGF）等促有丝分裂因子，同时营造类似于体内附植时的培养环境，使细胞的贴壁过程与胚胎在体内的附植过程相似，使内细胞团快速增殖；分化抑制作用则是由于饲养层细胞能分泌白血病抑制因子（Leukemia in－hibitory factor， LIF）等细胞分化抑制因子。

1．2 条件培养基

    有两种类型的条件培养基可用于培养胚胎干细胞。一种是直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF另一种是用细胞株制作的条件培养基。1981年，Martin最先应用PSA－1条件培养基分离小鼠ES细胞成功。常用的制备条件培养基的细胞有BRL、PSA－1、HBC等。目前，用于分离猪ES细胞的条件培养基，仅有Piedrahita等报道的BRL条件培养基，而且是与STO联合使用，才能成功分离猪ES细胞。

1．3  外源性分化抑制因子

    多种细胞团子均可作为外源性分化抑制因于抑制ES细胞的分化，如白血病抑制因子（Leukemia inhibitor factor,LIF）、白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）、睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor,CNTF）等。其中研究最多、使用最广泛的是LIF。LIF是一种天然的细胞因于，因其能诱导小鼠白血病细胞分化而得名，具有广泛的生物学活性。但是，Moors等的研究结果表明，在常规浓度下，这些分化抑制因子均不能有效地抑制猪内细胞团的分化。然而，Wianny等则报道使用高浓度的LIF可以抑制其分化而且可以提高其增殖速率。因此，在分离培养猪ES细胞时应使用较高浓度的分化抑制因子。

2 培养基

    培养基应能保证细胞的有效生长和增殖，用于ES细胞分离培养的培养基，包括基础培养基和添加物两部分。

2.1 基础培养基

      目前，培养猪ES细胞，主要是用DMEM作为基础培养基，但 Moors等在研究中发现，DMEM与 Ham’s－F10以 1:l的比例混合比单独使用DMEM培养结果更好。也有研究者尝试使用其它组合的基础培养基，即在DMEM中添加一定量的其它类型的合成培养基，均可以得到较理想的效果。

2.2 深加物

    基础培养基只能满足细胞培养的基本生长要求，要保证ES细胞的有效生长、增殖就必须添加其他成分。在ES细胞培养过程中，除要添加 LIF等外源性分化抑制因子外，还要添加血清、谷氨酸胺、β一巯基乙醇、胰岛素、非必需氨基酸抗生素等。

2．2．1  血清

    血清属于天然培养基，对细胞的生存、生长、增殖有很大的促进作用，但其缺点是成分不清，影响对结果的分析。ES细胞培养中，一般要添加 10％的小牛血清（v／v）和 10％的胎牛血清（v／v），也有人只加15％胎牛血清（v／v）。在猪ES细胞培养中，胎牛血清（10％）和猪血清（10％）联合使用效果更佳。

2.2.2β-巯基乙醇

    β一巯基乙醇是一种强还原剂，能使培养基中的含硫化合物还原成谷胱甘肽，防止氧化物对培养细胞的损害。同时，具有促进细胞增殖和贴壁的作用。Strojek等的研究结果表明，在其他培养条件相同的情况下，添加β-巯基乙醇可提高胚胎贴壁率及克隆形成率。

2．2.3 生长因子

    Strojek等研究了生长因子对猪ES细胞的影响，他们以添加或不添加胰岛素做对比实验，结果表明，胰岛素可大大提高ES细胞的分离效率。胰岛素可以促进细胞分裂，增加胚胎细胞数，对滋养层和内细胞团的增殖均有促进作用，能有效提高ES细胞的分离效率。在其它动物ES细胞的培养中，常用的生长因子还有表皮生长因子（Epibermal growth factor,EGF）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）等。此外，干细胞因子（stem cell factor，SCF）或称为Kit配体（Kit ligand，KL）----一种由骨髓微环境中的基质细胞产生的酸性糖蛋白，作为干细胞生长的唯一调控因子，能诱导干细胞进入细胞周期，对干细胞有显著的促分裂作用，并可以延长其存活期。因此，干细胞因子在ES细胞的克隆中具有巨大的应用潜力。

2.2．4 其他深加物

    在培养基中添加谷氨酰胺、核苷酸以及非必需氨基酸等主要是为细胞的生存、生长、增殖提供必要的合成材料和能量。

3  内细胞团的分离

    用于分离ES细胞的胚胎，一般取自经超排处理后人工受精或自然交配的受孕7－10天的母猪子宫。收集胚胎后，通过免疫手术法或组织培养法剔除滋养层细胞，获取具有全能性的内细胞团。

3．1  免疫手术法

    免疫手术法在分离内细胞团过程中较为通用，而且易于获得较纯净的胚胎干细胞，但要掌握好处理的程度，以免伤及内细胞团细胞。具体过程如下：胚胎在含有兔抗猪血清的DMEM培养液中培养15－25分钟，再在含有豚鼠血清的DMEM培养液中培养10－20分钟，这样滋养层细胞即被破坏，去除已溶解的滋养层细胞，即得到胚胎的内细胞团。

3．2  组织培养法

    组织培养法是直接将胚胎接种于饲养层上，待内细胞团充分增殖且未出现分化时，挑取并用胰蛋白酶消化后离散，再接种到新的饲养层上即可。

4  ES细胞的分离与建系

    分离ES细胞有两种途径，即先用免疫手术法或组织培养法从胚胎分离出内细胞团，再分离ES细胞；或者直接将胚胎用机械法或胰蛋白酶消化法离散成卵裂球，再将卵裂球接种培养，分离ES细胞。无论采用哪种方式，均要经过几次传代筛选后才能得到一定纯度的ES细胞。再消化离散、接种即可得到大量纯化的ES细胞，继续传代即可建系。

5  ES细胞的鉴定

    随着生物技术的不断发展，ES细胞的鉴定逐渐得到完善。ES细胞的鉴定主要围绕着ES细胞的形态、核型、细胞标记物和分化潜能等方面进行。近来，又提出了通过检测基因表达

来鉴定ES细胞分化状态的新方法，此方法不仅可以检测ES细胞是否分化，而且可以检测ES细胞的分化方向，为ES细胞的分离培养及诱导走向分化提供了有效的鉴定方法。

5．1  形态鉴定

    ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态特征，细胞体积小，圆形，核质比大，有1-2个核仁；细胞致密，细胞间无界限，形似鸟巢，集落周边整齐，与饲养层界限分明且色泽深亮。

5．2 核型分析

    正常的二倍体校型特征是ES细胞全能性（或多能性）的基础，只有具有正常核型的胚胎干细胞才能嵌合到受体着床前胚胎内，共同分化发育成胶合体动物。枝型分析的具体过程如下：以0．5％胰蛋白酶和0．2％EDTA消化处理ES细胞20分钟，加入等量10饲、牛血清终止消化，离心ES细胞并制成悬液。再加终浓度为 0．02ug／ml秋水仙素培养 1小时，800rpm离心 5分钟，去上清液，再用 0．56％的 KCI低渗处理20分钟，800rPm离心5分钟，去上清液，以固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）制成悬液，固定10分钟，再反复离心 3次。最后，

将悬液滴于预冷的载玻片上凉干，染色，观察，分析结果。

5．3  体外分化

      当培养密度高时，ES细胞会发生自发分化，形成肌细胞、成纤维细胞、神经细胞和内胚层细胞等。另外，若将ES细胞消化离散后悬浮培养，几天后形成细胞团，且在细胞团的一端出现边缘平滑的立方上皮细胞，另一端出现表面粗糙、非紧密连接的细胞，这些细胞团的发育形式与人畸胎瘤细胞相似。进一步培养形成类胚体，类胚体贴壁后，可分化形成外胚层、内胚层以及神经和肌肉细胞。

5．4  体内分化

    将分散的ES细胞，注射到裸鼠体例皮下（每侧约5×106个），6－8周后肿瘤形成。手术取瘤，常规方法制组织切片，染色并观察分析结果。分化潜能高的细胞肿瘤形成迅速，且分化细胞类型多。所形成的肿瘤必须有内、中、外三种胚层来源的细胞，才能证明胚胎干细胞具有完整的全能性。

5．5  特异性染色

    常用的是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase， AKP）染色和阶段性胚胎特异性抗原-1（Stage-Specific embry-onic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光标记染色两种方法。ES细胞和早期胚胎细胞等未分化的细胞表面含有丰富的AKP和SSEA-1，用特异性染色，即可进行检测。碱性磷酸酶染色的具体过程：将贴壁生长的ES细胞，在室温下用4％甲醛固定15分钟，PBS清洗：再以200ug/ml的奈酚AS－MX磷酸钠和1mg/ml的快红TR盐染色15分钟（PH=8．2），PBS清洗终止染色，阳性反应是棕红色。

    SSEA一1免疫荧光标记染色一般采用间接法，以提高其敏感性。常以抗SSEA－1单克隆克隆抗体为一抗，荧光标记的羊抗鼠lgG为二抗，分步染色，荧光显微镜下观察分析结果。

    而 Piedrahita等用细胞角蛋白18（Cytokeratin 18）和波形纤维（Vimentin）免疫荧光标记染色，结果显示猪和鼠的ES细胞均呈阴性反应，从而证明了ES细胞的未分化状态。这也不失为鉴定猪ES细胞的有效途径。

5.6 嵌合体

    通过显微注射法，向6或7无的囊胚期胚胎的囊胚腔注射15－20个ES细胞，再经胚胎移植手术，将其植入受体猪并产生后代。然后，通过检测ES细胞在嵌合体中的表达，确定其全能性或多能性。

6  存在的问题

    虽然鼠和人的部分ES细胞系已经可以传代培养两年以上，而且利用鼠ES细胞已获得生殖系嵌合体小鼠。但就猪而言，至今为止只建立了猪类ES细胞系，虽然已证明其具有多能性，但未见有利用其获得生殖系联合体猪的报道，而这又是鉴定ES细胞的最有效、最有说服力的方法。

7  应用前景

    猪ES细胞系不仅可用于克隆动物、转基因动物、基因敲除动物及嵌合体动物等的生产，以及进行猪的品种改良或为医学研究提供实验动物模型，并可进行细胞分化与胚胎发育机理的研究以及各种基因功能分析。由于猪与人在解剖、生理等方面十分相似，大小和体重也和人类相差不大，所以猪ES还可用于生产供异种器官移植的动物器官。①由于ES细胞系可以快速增殖，故以ES细胞作为核供体进行核移植，可以在短期内可获取大量基因型和表现型完

全相同的个体，即进行动物的克隆生产。②目前最常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射DNA，此法成功率很低，外源基因整合、表达和筛选工作在个体水平上进行，工作困难繁锁，周期长。而将带显性标记的DNA转入全能性ES细胞，事先鉴别出来整合的位置，即在细胞水平上进行筛选工作，再在体外克隆成系，经胚胎移植，即可形成带有外源目的基因定向整合的转基因猪。③将ES细胞注入受精卵内或将ES细胞与早期胚胎共同培养形成嵌合胚，再通过胚胎移植即可产生嵌合体动物，以获得新的性状。④细胞分化是发育生物学的重要课题，但胚胎所处的特殊环境使得此项技术遇到种种障碍。如果用胚胎干细胞进行实验．就可以避开这些障碍．直接观察细胞的分化、发育的基因调控，推动基础研究的发展。⑤将人基因导人猪的ES细胞生产含人基因的猪，利用转基因猪为人类提供器官移植的材料。猪作为

人类器官移植的供体动物有以下一些优势：妊娠期短，产仔多，后代生长快，更重要的是不同发育时期猪的器官，诸如心脏、肾等与不同年龄的人的器官在大小上比较接近，极有可能代替病人的某些器官。