3.2.15 吡咯嘧啶酸标准品：纯度 ≥99％。
3.2.16 吡咯嘧啶酸标准液：准确称取吡咯嘧啶酸 10.0 mg,溶于 100 mL硼酸缓冲液( pH 10.0)中配成 0.100 mg/L 的储备液。根据需要用甲醇－水－乙腈( 4＋5＋2)稀释配制成适当浓度的标准工作液。
3.3 仪器和设备
3.3.1 高速均质器：3 000 r/min。
3.3.2 离心机：3 000 r/min。
3.3.3 振荡器。
3.3.4 旋转蒸发器。
3.3.5 液相色谱仪配有紫外检测器。
3.3.6 微量注射器：100 μL。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取和净化
称取试样 5.0g(精确至 0.1g),置于均质器中,加入无水硫酸钠 10 g 及三氯甲烷－甲醇 (2＋1) 混合液 100mL ,均质 1 min, 3 000 r/min 离心10 min后,将提取液转入500 mL 分液漏斗中。于残留物中再加三氯甲烷－甲醇(2＋1) 混合液 75 mL ,同样操作。
合并提取液。加入缓冲液 (pH 3)50mL ,振摇 5 min 。静置分层,取下层。于上层中加入三氯甲烷 40 mL ,同样操作。合并下层溶液。用旋转蒸发器浓缩至干。将残留物用乙腈10 mL 及正己烷50 mL移入预先加入 2％ 氯化钠溶液100 mL 的500 mL 的分液漏斗中,振摇10 min,静置分层,取下层置于另一分液漏斗中。于上层中再加入乙腈 10mL ,振摇5 min后,静置分层。合并下层溶液,再振摇5 min,静置分层,弃去上层溶液。于下层溶液中加入二氯甲烷 50 mL,振摇 10 min。静置分层,取下层二氯甲烷。上层再用二氯甲烷50 mL作同样操作。合并二氯甲烷层并使其全部通过装有 5 g 无水硫酸钠柱,滤入蒸馏瓶中,用旋转蒸发器将二氯甲烷层浓缩至干。加入甲醇－水－乙腈(4＋5＋2)1.0 mL以溶解残留物,供测定。
3.4.2 测定
3.4.2.1 色谱条件
a. 色谱柱:250 mm × 3.9 mm (内径),μ Bondapak C18 10μm 粒度；
b. 流动相：甲醇－柠檬酸 (0.1 mol/L)－乙腈 (4＋5＋2) (含0.025％十二烷基磺酸钠)；
c. 流速：1 mL/min；
d. 检定波长： 280 nm。
3.4.2.2 色谱测定
分别将等体积标准工作液、样液注入液相色谱仪,测量峰面积(或峰高)。
吡咯嘧啶酸响应值应在仪器测定线性范围内。吡咯嘧啶酸保留时间约 10 min。
3.4.3 空白试验
除不称取样品外,按上述测定步骤进行。
3.5 结果计算和表述
按下式计算试样中吡咯嘧啶酸的含量：
A·c·V
X=━━━━━━
As·M
式中：X——试样中吡咯嘧啶酸含量,mg/kg；
A——样液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高),mm**2(或 mm)；
As——标准工作溶液中吡咯嘧啶酸色谱峰面积(或峰高), mm**2(或 mm)；
c——标准工作溶液中吡咯嘧啶酸的浓度,μg/mL；
V——样液最后定容体积,mL；
m——试样量,g。
注：计算结果需扣除空白值。
4 测定低限、回收率
4.1 测定低限
本方法测定低限为 0.05 mg/kg。
4.2 回收率
回收率的实验数据：吡咯嘧啶酸添加浓度在 0.05～0.4 mg/kg 范围内,回收率为76.7％～89.7％。
注：考虑到柠檬酸对色谱柱的使用寿命有影响,也可用0.5 mol/L的 H3PO4 溶液调节pH到4的甲醇－水－乙腈(25＋55＋20)作流动相。 上一页 [1] [2] |
