| 摘 要 为探讨饲用a-半乳糖苷酶固态发酵的生产条件，对培养基中关键成分碳源、氮源进行了优化筛选，选择豆粕、甜菜渣、硫酸铵和磷酸氢二钾为四个主要因素，每个因素设三个水平，按正交设计表 L9(34) 安排试验。极差分析结果表明，各因素的水平依次为16%、4%、2%和2%时，酶活力达到172U/g以上。随后选择豆粕、甜菜渣和磷酸氢二氢钾的三因素水平进行响应面分析试验，结果表明，当培养基中豆粕为19.2%、甜菜渣为3.89%和磷酸氢二钾为2.92%时的理论酶活值最高（为174.98U/g），实验印证了这一结论。
关键词 碳源，氮源，a-半乳糖苷酶，固态发酵，响应面分析
饲用a-半乳糖苷酶是催化水解含有a-D-半乳糖苷键的酶类。它能水解非还原性末端以a-1,6键结合的半乳糖苷化合物，从而消除饲料原料中的抗营养因子，提高动物生产性能，在饲料工业领域的应用前景广阔[1]。青霉菌属化能自养型微生物，碳源需要量最大，其次是氮源。在无机盐中，磷、硫需要量稍大，钾、镁次之。其它元素和生长因子的需要量一般很少。在发酵生产中，除了培养环境因素，培养基各种营养成分的选择及其最佳配比也是发酵工艺研究的重要内容，这些成分包括碳源、氮源、矿物元素、微量元素、缓冲剂、生长促进剂和产物的诱导物或前体物等[2]。培养基的选择还需要考虑诸如黏性、透气性、制备和成本[3-4]。从生产实际角度出发，选择碳源和氮源应该廉价和来源丰富，常常是一些工农业副产品作为固态发酵的底物。对饲用a-半乳糖苷酶固态发酵生产底物优化的体统研究还未见报道。
本试验旨在采用正交试验设计和响应面分析法[5]优化产a-半乳糖苷酶的培养基，为规模化生产提供依据。
1、材料与方法
1.1、菌株
本实验室保存的青霉MAFIC-6（Penicillium sp. MAFIC-6）。
1.2、主要仪器
生物安全柜（NU-425-400E），蒸汽消毒器（YX2808B），全温振荡培养箱（HZQ-F160），80 L恒温培养箱（HH B11 300-360）；高压灭菌锅（DKB-8A型）。
1.3 、培养基及原料
原料：碳源麸皮、甜菜渣，氮源大豆粕，取自饲料原料或工农业加工副产品；(NH4)2SO4，KH2PO4均购自北京化学试剂公司。
斜面培养基：PDA斜面或Czapeck-Dox培养基。
固态发酵培养基：根据试验需要由麸皮以及上述其它原料、无机盐和微量元素溶液配合而成。其中水分含量调至55%，表面活性剂按干基重0.1%添加（预先溶于去离子水）。
矿物盐溶液（g L-1）：KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.001，pH 6.0。
培养条件：装曲量为40 g/250mL，接种量1mL（> 1.0 ´ 108个孢子），29℃恒温培养72~96 h。
1.4 、酶活分析及数据处理
试剂配制和测定方法参照王春林等[6]。采用SAS 8.0进行方差分析及响应面分析，用STATISTICA 6.0软件作响应面趋势图。
2 、结果与讨论
2.1、 正交设计试验
结合前人试验的结果[2, 3, 7]，综合考虑工业化生产的经济性，选用麸皮、豆粕、甜菜渣、硫酸铵和磷酸氢二钾作为固态发酵生产GAL的基本原料。采用正交试验设计，以这四种原料为四个主要因素，每个因素以其在干曲中的质量百分比例设定三个水平（表1），按正交设计表 L9(34) 安排试验，固态发酵培养条件一致。
结果见表2，各因素水平组合中A2B1C2D3的活力最高，达到172.89 U/g。极差分析结果表明，四因素对酶活力的影响依为是甜菜渣、豆粕、硫酸铵和磷酸氢二钾。各因素/水平均值（m）的趋势图比较表明（图1），A3B1C2D3的组合能得到最大的酶活，此时各因素的添加水平依次为16%、4%、2%和2%。豆粕、甜菜渣、和磷酸氢二钾的添加量还有待于进一步确定。
表1 因素水平
|
水平Levels |
因素Factors，% |
|
A（豆粕） |
B（甜菜渣） |
C（硫酸铵） |
D（磷酸氢二钾） |
|
1 |
4.0 |
4.0 |
1.0 |
0.5 |
|
2 |
10.0 |
8.0 |
2.0 |
1.0 |
|
3 |
16.0 |
12.0 |
4.0 |
2.0 |
表2 正交试验结果
|
试验号
Test No. |
A |
B |
C |
D |
a-半乳糖苷酶活力
GAL activity，U/g |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
104.55 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
114.75 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
95.71 |
|
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
172.89 |
|
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
108.8 |
|
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
96.73 |
|
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
160.65 |
|
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
121.55 |
|
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
109.82 |
|
m1 |
105.00 |
146.03 |
107.61 |
107.72 |
|
|
m2 |
126.14 |
115.03 |
132.49 |
124.04 |
|
|
m3 |
130.67 |
100.75 |
121.72 |
130.05 |
|
|
R |
25.67 |
45.28 |
24.88 |
22.33 |
|
图1 因素/水平作用趋势
2.2、 响应面分析试验（RSM试验）
由上述试验结果可知，豆粕和甜菜渣对产酶的影响较大，硫酸铵的适宜水平在2.0%左右。采用响应面分析法进一步优化固态发酵时菌体产酶所需成分的适宜浓度范围。试验的培养基浓度与编码水平设置如表3。
表3 响应分析因素与编码
|
水平Levels |
因素Factors，%（w/w） |
|
大豆粕（X1）
Soybean meal |
甜菜渣（X2）
Beet pulp |
KH2PO4（X3） |
|
-1 |
12.0 |
2.0 |
1.5 |
|
0 |
16.0 |
4.0 |
2.5 |
|
1 |
24.0 |
6.0 |
3.5 |
在考虑三种因素对青霉MAFIC-6产a-半乳糖苷酶的影响时，采用了Box-Wilson中心组合设计，用表3设置的三因素三水平的方式分别进行15组试验，除了三个变量因子外，不足部分用麸皮补齐，其它培养条件相同，培养基结果见表4。对试验结果进行二次回归分析，以酶活力（Y）为响应值，各试验因子对响应值的影响可用下列函数表示：
Y = 165.92 + 18.36X1 - 11.52X2 + 6.16X3 - 11.52X12 - 22.31X22 - 24.01X32 + 4.25X1X2 + 4.25X1X2 - 1.45X2X3，R2 = 0.8949。
为了探讨回归方程预报的试验结果与实际结果相符合的程度，将试验值与模型计算值相比，由表4可知，两者酶活在130 U/g以上的相当一致，相对误差在 ± 10%以内。
表4 响应面试验设计和结果
|
试验号
Number
|
因素及水平
Factors and levels |
|
a-半乳糖苷酶活力
GAL Activity，U/g |
|
X1 |
X2 |
X3 |
|
观察值
Observed |
理论值
Predicted |
相对误差，%
Relative error |
|
1 |
-1 |
-1 |
0 |
|
116.62 |
129.50 |
-11.04 |
|
2 |
-1 |
0 |
-1 |
| | 