1、 原理

　　凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。

　　2、试剂

　　2.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98％，无氮。

　　2.2 混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水（GB 665），6g硫酸钾（HG 3—920）或硫酸钠（HG 3—908），均为化学纯，磨碎混匀。

　　2.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40％水溶液（m/V）。

　　2.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2％水溶液（m/V）。

　　2.5 混合指示剂：甲基红（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220）0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。

　　2.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备。

　　2.6.1 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.1mol/L。8.3mL盐酸（GB 622，分析纯），注入 1 000mL蒸馏水中。

　　2.6.2 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL盐酸（GB 622，分析纯），注入1 000mL蒸馏水中。

　　2.7 蔗糖（HG 3—1001）：分析纯。

　　2.8 硫酸铵（GB 1396）：分析纯，干燥。

　　2.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1％甲基红乙醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。

　　3、 仪器设备

　　3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。

　　3.2 分样筛：孔径0.45mm（40目）。

　　3.3 分析天平：感量0.0001g。

　　3.4 消煮炉或电炉。

　　3.5 滴定管：酸式，10、25mL。

　　3.6 凯氏烧瓶：250mL。

　　3.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸气蒸馏式。

　　3.8 锥形瓶：150、250mL。

　　3.9 容量瓶：100mL。

　　3.10 消煮管：250mL。

　　3.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动。

　　4、 试样的选取和制备

　　选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。

　　5 分析步骤

　　5.1.1 试样的消煮

　　称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸 和2粒玻璃珠，将 凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力 （360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。

　　5.1.2 氨的蒸馏：

　　将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器 的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

　　5.1.2.3 蒸馏步骤的检验    精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按5.1.2步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。

　　5.1.3 滴定    用5.1.2.1或5.1.2.2法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。

　　6 、空白测定    称取蔗糖0.5g，代替试样，按第5章进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3mL。

　　7、 分析结果的表述

　　7.1 计算见下式：

　　粗蛋白质（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100

　　式中：V2── 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；      V1── 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；      c── 盐酸标准溶液浓度，mol/L；      m── 试样质量，g；       V── 试样分解液总体积，mL；      V── 试样分解液蒸馏用体积，mL；       0.0140── 与1.00mL盐酸标准溶液〔c（HCl）=1.000mol/L〕相当的、以克表示的氮的质量。       6.25── 氮换算成蛋白质的平均系数。      7.2 重复性    每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

　　当粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％。

　　当粗蛋白含量在10％～25％之间时，允许相对偏差为2％。

　　当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。