橙血清倾倒平板法微生物测试（引自可口可乐热充填之监控和品控要求手册）

1.培养基和试剂：

a)异丙醇

b)预配好和已消毒的10％酒石酸溶液

c)橙血清琼脂（OSA）

2.设备和仪器

a)消毒处理过的塑料吸管或消毒过的玻璃吸管，或消毒处理过的注射器(带针头的)

b)己消毒的有盖培养皿。

c)可维持温度在44℃—46℃的恒温水浴锅。

d)可维持温度在28C+/一1.0℃(Y&M)和35r+/一1.0℃(Tc)的培养箱

e)已消毒的注射器，10cc

f）一次性的塑料注射过滤器

3.操作步骤：

3.1.准备培养基

3.1.1粉剂无水橙血清琼脂应按照制造商的指示进行准备。按照每升橙血清琼脂加入己消毒的约等于14毫升10％的酒石酸的比率，酒石酸必须以无污染的方法加入以消毒的橙血清琼脂(最后的PH值需要在3.6—4.0之间)。最简单的方法是用一个一次性已消毒的注射器来做。在把橙血清琼脂从44℃—46℃的恒温水浴取出后，打开一个一次性已消毒的注射器，吸取10％的酒石酸到注射器，注射10％的酒石酸到培养基中。

3.2样品测试

3.2.1将已经于30℃环境下培养的样品取出并放置到微生物实验室。

3.2.2用酒精灯擦拭工作台。要注意任何明火，如火炉。酒精是非常易燃的液体。

3.2.3开一包已消毒的有盖培养皿并将平板安排放置于工作台上。

3.2.4在每个平板底部写上样品的标识符号。即使平板掉落并且盖子飞出，每个平板的标识也不会被遗失。

3.2.5对每个样品用一个新的吸管。

3.2.6接从每个样品中以无菌的方法取出样品并移至有盖培养皿。以无污染

3.2.7将以消毒的、融解的橙血清琼脂培养基（12~20ml,最高温度=46℃）倒入有盖的培养皿

3.2.8轻轻的晃动以彻底混合培养基和样品。混合物不要从培养皿的边缘溅出。

3.2.9让混合物在一个水平面凝固10分钟。

3.3平板培养

3.3.1平板凝固后，倒转平板以防止平扳表面覆盖的水汽凝结滴落而散布菌落。

3.3.2平板要在28℃十／——1.0℃(Y＆M)和35℃十／—1.0℃(T&C)的环境下培养。

4.菌落计数

4.1总菌数：必须分别在培养24小时和72小时后计算菌数。点计所有菌落（不管类型），并记录最高数目。

4.2酵母菌和霉菌数：在培养48小时后点计酵母菌和霉菌数，并在此后每隔24小时再点计一次，直到过第5天，记录最高数目。

酵母菌通常为圆形的白色菌落。有时它们也带有颜色。在一天至两天以后，一些酵母菌菌落的中心因吸收培养剂中指示剂而变成蓝色。

霉菌菌落会显示不同的颜色（包括白色、黄色、红色、蓝色、或黑色），但从其“绒毛状”或“棉花状”外观很容易辨认这种菌落。通常，霉菌菌落比细菌或酵母菌的菌落为大。

4.3大肠杆菌数：大肠杆菌菌落呈绿色或墨绿色，并有明显的金属光泽。在培养24小时后，只计算有金属光泽的菌落。

注：橙血清琼脂上，酵母菌和细菌是无法用肉眼分别的。故除非借助显微镜，除霉菌之外都当酵母菌计。大肠菌群的颜色是红色的。