益生菌制剂被认为是最有前景的抗生素替代品之一，具有改善动物生产性能、提高机体免疫力、维持肠道微生态平衡等功能，其中乳酸菌、芽孢杆菌是应用最多的理想菌种[1]。越来越多的研究证实，发酵饲料代替饲用抗生素具有很好的应用前景[2-3]。

　　丁酸梭菌(Clostridium butyrium)是归属于梭菌属的革兰阳性厌氧芽孢杆菌, 存在于土壤、动物和人体的肠道中，同双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪链球菌一样，能够有效抑制肠道内致病菌的繁殖殖[4]，同时，丁酸梭菌的主要代谢产物为丁酸，而丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复的主要营养物质。因此，丁酸梭菌对肠道上皮组织的再生和修复有很重要的意义[5]，是调节人体及动物体肠道微生态平衡的有益菌。

　　微生物混合培养具有很重要的应用价值，己有研究表明混合培养可显著提高菌株生物量和生理代谢功能，能产生优于纯培养的效果[6-8]，王松丽等使用丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌混合培养，相比于纯培养，混合培养生物量分别提高了80%和51.7%[9]，朱晓慧，唐宝英等研究了丁酸梭菌对双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的增殖作用和共生关系，表明三种菌在共培养条件下，活菌数分别增长了约24%，43%和7%[10]。

　　目前国内对丁酸梭菌液态发酵研究较多，但其成本高，设备复杂，操作繁琐，本研究以丁酸梭菌，粪肠球菌，枯草芽孢杆菌为发酵菌种，研究了在不同基质及菌种组合条件下，菌种的发酵特性，为丁酸梭菌固态发酵提供了参考。

　　1. 实验材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1 菌种

　　丁酸梭菌C-103.粪肠球菌A-301.枯草芽孢杆菌Y-01.均由好实沃生物保藏提供。

　　1.1.2 培养基

　　RCM琼脂培养基：以胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、氯化钠、琼脂为主要成分，pH7.2 ，121℃灭菌20min，用于丁酸梭菌的增殖培养

　　亚硫酸铁琼脂培养基：以胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、偏重亚硫酸钠、琼脂等配合。pH值 7.5 - 7.7.121℃灭菌20min， 用于丁酸梭菌活菌计数。

　　MRS培养基：以蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、K2HP04、蒸馏水，调节pH为7.0.115℃灭菌30min，固体计数培养基加琼脂与CaCO3.用于粪肠球菌活菌计数。

　　LB培养基：酵母膏、蛋白胨、氯化钠、pH7.0.121℃灭菌20min,固体计数培养基加琼脂，用于枯草芽孢杆菌活菌计数。

　　1.1.3 发酵底物

　　表1 发酵基质中干物质比例

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 菌种制备

　　将保存于4℃冰箱的斜面种子挑取少许接种装有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，37℃恒温培养24h，备用，其中丁酸梭菌摇瓶37℃厌氧培养，粪肠球菌与枯草芽孢杆菌37℃，培养24h后备用。

　　1.2.2 发酵菌种组合

　　固态发酵培养基中各菌种初始浓度设计为105cfu/g数量级：丁酸梭菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌比例为：2：10：1.以此为标准，设计以下菌种组合：丁酸梭菌+粪肠球菌，丁酸梭菌+枯草芽孢杆菌，丁酸梭菌+粪肠球菌+枯草芽孢杆菌，分别接种于发酵培养基，发酵温度37℃，含水量42.0%，发酵48h后测定活菌数与pH。

　　1.2.3 发酵时间

　　固态发酵培养基中各菌种初始浓度及菌种以以上标准组合设计，接种于发酵培养基，发酵温度 37℃，含水量42.0%，发酵12h，24h，36h，48h，60h，72h时，测定活菌数与pH。

　　1.2.4发酵温度

　　固态发酵培养基接种后分别在28℃，32℃，37℃，42℃条件下发酵48h后测活菌数。

　　1.2.5发酵水分含量

　　固态发酵培养基接种后以发酵温度37℃，分别在水分含量30%，35%，40%，45%，50%条件下，发酵48h后测活菌数，pH。

　　1.2.6检测方法

　　活菌数的检测，发酵结束后取10.0g发酵饲料，加入至90ml无菌生理盐水，震荡20min后，检测活菌数。

　　pH的测定：发酵结束后取10.0g发酵饲料，加入至90ml纯净水中，震荡20min后，测定pH。

　　2. 结果与讨论

　　2.1 发酵菌种组合

　　图1 发酵菌种组合

　　A：丁酸梭菌+粪肠球菌;B：丁酸梭菌+枯草芽孢杆菌;C：丁酸梭菌+粪肠球菌+枯草芽孢杆菌

　　丁酸梭菌与粪肠球菌，枯草芽孢杆菌不同组合混合发酵效果见图1所示，丁酸梭菌与粪肠球菌或枯草芽孢杆菌组合，发酵效果较三种细菌组合发酵效果较差，可能是因为与粪肠球菌组合，肠球菌发酵产酸能力较强，同时因为氧气的存在，使得丁酸梭菌延迟期长，且由于底物抑制，生长效果较差，虽然与枯草芽孢杆菌组合发酵，可以通过芽孢对氧的消耗，创造较好的厌氧条件，但是由于丁酸梭菌产酸相对粪肠球菌较差，所以发酵结束后pH较高，不适合发酵饲料的存贮，所以，三种菌种共同发酵，既能降低发酵环境中氧的浓度，为丁酸梭菌生长提供良好的厌氧环境，同时，能够较大的降低发酵饲料pH，三种菌种共同发酵，最终活菌数分别能达到：丁酸梭菌1.5×107cfu/ml，粪肠球菌1.9×109cfu/ml，枯草芽孢杆菌1.1×105cfu/ml，发酵饲料pH3.9.

　　2.2 发酵时间

　　图2 发酵时间对发酵效果的影响

　　由图2可知，发酵时间在0~48h内，丁酸梭菌与粪肠球菌活菌数处于增长状态，pH下降迅速，当超过48h，发酵环境中pH较低，有害代谢产物积累，底物与代谢产物抑制明显，出现菌体自溶，pH回升现象，所以，最佳发酵时间为48h。

　　2.3 发酵温度

　　温度是微生物发酵的重要环境指标，对菌体能否快速生长繁殖起着重要的作用，如图3所示，随着发酵温度的升高，粪肠球菌，丁酸梭菌活菌数先升高后降低，在温度为37℃ 时活菌数达到最大，丁酸梭菌，粪肠球菌活菌数分别达到2.5×107cfu/ml，2.2×109cfu/ml。温度较低或较高都会影响菌体的生长，主要是影响微生物细胞内酶的活性表达，所以，选取37℃作为最佳发酵温度。

　　图3 发酵温度对发酵效果的影响

　　2.4 发酵水分含量

　　图4 水分含量对发酵效果的影响

　　发酵底物中的水分含量主要影响发酵过程中氧与营养物质的传质，水分过低，营养物质分散均匀度价差，代谢产物积累，底物抑制明显，水分过高，容易在发酵过程中造成杂菌污染，导致发酵饲料腐败，由图4可知，在不同水分含量条件下发酵，当水分含量为40%时，丁酸梭菌，粪肠球菌活菌数达到最大，水分过低，活菌数偏少，水分过高，发酵后期染菌现象明显，所以，选择40%作为最适发酵水分含量。

　　3. 结论

　　本研究以麸皮，豆粕，玉米粉混合基质作为发酵底物，研究了丁酸梭菌与粪肠球菌，枯草芽孢杆菌混合菌种对该底物的发酵效果及最佳发酵工艺，最佳发酵菌种组合及发酵工艺。该研究对丁酸梭菌应用于固态发酵，提供了一定的思路，同时，对于不同来源底物，菌种组合仍需进一步的研究。

　　参考文献

　　[1] CHRISTINE NV，CHOU W K，BILLY MH，et al. Role of probiotics on immune function and theirrelationshipto anti- biotic growth promoters in poultry，a brief review[J]. International Journal of probiotics &prebiotics，2016.11( 1) : 1—6.

　　[2] 俞清霞. 益生菌发酵豆粕对仔猪生长性能的影响[J]. 福建畜牧兽医，2011.33( 5) :27—28.

　　[3] WANG Y，LIU X T，WANG H L，et al. Optimization of processing conditions for solid-state fermented soybean meal and its effects on growth performance and nutrient di- gestibility of weanling pigs[J]. Livestock Science，2014. 170: 91—99..

　　[4] 谢树贵, 戴青, 赵述淼, 等. 丁酸梭菌对动物致病菌的拮抗作用研究[J]. 湖北农业科学, 2007. 46(3): 424-427.

　　[5] 唐宝英,朱晓慧,刘佳.新一代微生态制剂一酪酸菌的研究和开发前景仁[J].中国微生态学杂志, 2000.12(5):297—297.

　　[6] 李春笋,郭顺星.微生物混合发酵的研究及应用[J].微生物学通报,2004.31(3):156-161(Ch).

　　[7] 熊海燕,王为国,王存文,等.混合菌培养及其在工业上的应用[J].贵州工,2004.29(3):16-18