随着我国畜牧业迅速发展，家禽养殖规模不断扩大，肉鸡占家禽养殖较大比重。大肠杆菌是肉鸡生产中最为常见的致病菌，其危害大、传播性强，不仅危害家禽.还会传染人类，是常见的细菌性人畜共患病。在临床使用当中，抗生素对治疗禽大肠杆菌疾病有着明显的效果。在肉鸡养殖中，不合理使用抗生素，导致的滥用问题也日趋严重，长期大量滥用抗生素导致免疫力下降肠道菌群失调，更易感染病原菌。根据中华人民共和国农业农村部《2021年中国兽用抗荣药使用情况报告数据显示，2020年全年中国大陆境内使用的抗菌药总量为32 776.298 t。长期使用广谱类抗生素会导致病原菌耐药性增强，药物本身还会对畜禽机体产生毒副作用，损伤肝脏功能导致鸡急性中毒死亡，影响肾功能，损伤肾小管引起肾功能代谢不全。中国农业部发布《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案(2021-2025年)》，提出到2025年底规模养殖场要做到规范科学用药，让畜禽产品更安全。

　　益生菌是一类对动物机体有益的活性微生物。通过在动物胃肠道生存定植，不断生长繁殖，产生一些具有较强生理活性的代谢产物。如酶类，可以促进食物消化，增加营养物质吸收;有机酸，有抑制病原微生物生长或杀死病原微生物的作用;一些免疫物质，可以提高机体免疫力。益生菌具有的抑制有害菌生长，调节机体免疫功能，促进营养物质消化吸收的生理功能已经过科学证明，能对肠道起有益作用。益生菌制剂在养禽业提高肉鸡生产性能、提高蛋鸡产蛋性能上早有应用。肉鸡上常用的益生菌有芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、双歧杆菌等，但使用效果参差不齐，有待进一步优化产品性能。

　　本试验使用自主分离的禽源粪肠球菌、枯草芽孢杆菌，通过功能性和适应性考量，从体外进行抑菌试验，后制成复合益生菌剂，饲喂肉鸡，检测体内效果。寻求能够抑制常见致病菌的益生菌作为生物制剂以代替抗生素使用，为益生菌在肉鸡养殖上的应用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌种来源

　　粪肠球菌和枯草芽孢杆菌由江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院益生菌团队分离获得，保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号分别为CGMCC25043和CGMCC14246.禽源大肠杆菌由南京农业大学动物医学院畜禽营养代谢病教研组提供，为大肠杆菌标准株CGM-CC25922.

　　1.2 菌剂制备

　　分别用MRS 培养基、酵母膏胨葡萄糖培养基(YEPD)、肉汤培养基，将粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和禽源大肠杆菌菌种活化。后扩增培养，将培养液按 10倍比稀释，计数发酵液中的活菌数量。粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和禽源大肠杆菌的活菌数量，分别达到4×109、2×109、3×109CFU/ml后至4℃冰箱备用。

　　1.3 益生菌与禽源大肠杆菌共培养

　　分别取粪肠球菌、枯草芽孢杆菌和禽源大肠杆菌发酵菌液，用1%的蛋白胨生理盐水稀释至10⁹CFU/ml，备用。

　　各取100μl稀释后的粪肠球菌和禽源大肠杆菌，分别接种到5ml肉汤培养基中。同时各取100μl稀释后的枯草芽孢杆菌与大肠杆菌共培养，在同等条件下以大肠杆菌单独培养作为空白对照，至37℃培养。分别于培养后的12、24、36、48和96h取100μ1共培养液，采用活菌计数大肠杆菌数量，将培养液按10倍比稀释，分别涂布于伊红美兰琼脂平板上(EMB)，37℃培养18h后计数大肠杆菌菌落数。

　　1.4 益生菌发酵滤液的制备

　　分别取粪肠球菌、枯草芽孢杆菌发酵菌液3ml，1000rpm/min 离心10min后，取100μl上清液。再用0.45μm滤器过滤除去菌体，收集滤液即为发酵滤液。使用牛津杯法，开展益生菌抑制大肠杆菌试验。

　　1.5 动物与分组

　　将300只1日龄的黄羽肉鸡40.69g±1.27g随机分成3组，每组5个重复，每个重复20只。分成对照组、复合益生菌组和抗生素组(黄霉素组)。

　　复合益生菌组日粮配置：将发酵后的粪肠球菌、枯草芽孢杆菌按体积比1∶1混匀。取300ml混合菌液，与100kg基础日粮混合均匀，制得益生菌组日粮。抗生素组日粮配置：取基础日粮100kg与0.4g黄霉素粉剂混合均匀，制成4mg/kg浓度的抗生素日粮。基础日粮配方见表 1.

　　表1基础日粮组成和营养水平

　　1.6 饲养管理

　　试验期共48d，分为前期(1～24d)和后期(25～48d)2个饲养阶段，自由采食和自由饮水，24h光照，温度控制在24.0～30.5℃。饲养管理按鸡场的常规免疫程序和管理制度进行。

　　1.7 测定指标及方法

　　1.7.1 血浆样品制备

　　整个饲养试验结束后，禁食12h之后，随机从每个重复抽取6只鸡，颈静脉放血屠宰。血浆样品制备:采用翅静脉采血，用含肝素钠的抗凝试管盛取血液，后用3000rpm/min离心12min，其上清液分装于1.5ml Eppendorf管中，置-20℃低温冰箱中保存，以备血浆抗氧化指标的检测。

　　1.7.2 抗氧化指标

　　血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶活性(SOD)、总抗氧化能力。采用试剂盒检测各项指标，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.7.3 肠道菌群

　　于试验第56天，在每个重复随机选择2只鸡进行屠宰，屠宰鸡均取一侧盲肠放人液氮中，以备微生物测定。测定时，在超净台中称取盲肠内容物1g，加入9ml灭菌生理盐水，充分摇匀，进行逐级10倍稀释，取合适梯度的细菌稀释液100ml接种到麦康凯培养基上，用于计数大肠杆菌;使用MRS固体培养基计数样品总乳酸菌。后将稀释的样品于85℃，放置30 min以除去其他细菌，后取100μl涂布至YPD 固体培养基上，计数总芽孢杆菌。平板放置培养箱中培养18～20h后进行计数菌落数量。

　　1.8 统计分析

　　试验数据用SPSS17.0软件进行统计分析。差异显著者进行Dμ-ncan氏法进行多重比较以“平均值±标准差”表示。

　　2 结果

　　2.1 益生菌与禽源大肠杆菌共培养

　　表2 不同培养时间的大肠杆菌数量CFU/ml

　　注:同行肩标不同大写字母表示差异极显著(P <0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母肩标表示差异不显著(P >0.05)，下同。

　　结果见表2.粪肠球菌与大肠杆菌共培养12 h后，其中的大肠杆菌数量从对照组的2×10⁹CFU/ml降低到2×10⁵CFU/ml，至24h后，培养液中的大肠杆菌数量降低到5×10²CFU/ml，至36h后培养液中检测不出大肠杆菌数。枯草芽孢杆菌与大肠杆菌共培养12h后，其中的大肠杆菌数量对照组的降低到6.5×106CFU/ml，至24h后，培养液中的大肠杆菌数量降低到1×10⁵CFU/ml，至36h降至4×10³CFU/ml，至48h后培养液中检测不出大肠杆菌数，均极显著低于对照组(P<0.01)。

　　2.2 牛津杯法检测抑菌效果

　　采用牛津杯法检测抑制禽源大肠杆菌的效果，在添加粪肠球菌和枯草芽孢杆菌发酵滤液的牛津杯周围出现明显的抑菌圈，直径分别为(20.12±0.45) (15.54±0.45)mm。见图1、图2.对照组为生理盐水，无抑菌圈出现。

　　2.3 益生菌对鸡血液抗氧化力的影响

　　结果见表3.鸡饲喂益生菌48天后，与对照组相比血浆中MDA含量显著下降(P<0.05)，总抗氧化能力水平得到一定提升(P<0.05)。与对照组相比，SOD活力没有差异性(P>0.05)。抗生素组血清抗氧化能力显著，MDA水平显著低于对照组(P<0.05)，与益生菌组没有显著差异(P>0.05);总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05)，与益生菌组没有显著差异(P>0.05)。

　　表3 添加益生菌对肉鸡血浆抗氧化力的影响

　　2.4 枯草芽孢杆菌对鸡肠道菌群的影响

　　在饲喂枯草芽孢杆菌后48天，盲肠菌群结果见表4所示，与对照组相比，益生菌组鸡盲肠内容物中大肠杆菌数量显著下降，乳酸菌和总芽孢杆菌数量显著高于对照组(P<0.01)。而抗生素组盲肠大肠杆菌、乳酸菌和总芽孢杆菌数量皆极显著低干对照组(P<0.01)。

　　表4添加益生菌对肉鸡盲肠菌群的影响结果

　　3 讨论

　　3.1 益生菌对大肠杆菌的抑制

　　研究报道粪肠球菌、凝结芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌在生长稳定期就能产生抑菌物质，其对革兰氏阳性菌，尤其是对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、艰难梭菌有很好的抑制作用。粪肠球菌和枯草芽孢杆菌会产生细菌素，并能通过营养竞争的方式来抑制大肠杆菌的生长，对有害微生物起抑制和杀灭作用。同时粪肠球菌和枯草芽孢杆菌在菌体的生长过程中能够产生短链有机酸等挥发性脂肪酸，这些酸类物质能降低动物肠道pH值，可有效抑制大肠杆菌的生长。

　　3.2 对肉鸡抗氧化的影响

　　活细胞抗氧化系统的第一道防线负责制止自由基的生成和脂质过氧化，过量的自由基可损伤蛋白质、核酸等生物大分子物质，并产生大量的MDA，造成组织细胞损伤，影响机体内环境的相对稳定，从而诱发许多疾病的发生。通过测定机体MDA含量、SOD酶活力和总抗氧化能力水平可以反映机体抗氧化水平。本实验结果表明，枯草芽孢杆菌会对机体的总抗氧化能力和MDA含量产生影响，而对SOD酶活力没有影响，与翟召静、杨曦报道一致。锰和铜为SOD蛋白酶的活性中心元素，其可能机制为芽孢杆菌不会增强机体锰和铜的吸收，对SOD酶活力的影响不显著。

　　3.3 对盲肠微生物区系的影响

　　罗敏、李红斌研究表明，给肉鸡补充粪肠球菌和芽孢杆菌可显著降低盲肠菌群中产气荚膜杆菌及其他有害菌的数量。粪肠球菌和芽孢杆菌属于我国农业部规定的饲用益生菌，可改善肠道内环境;两株菌自身具有生长力强，繁殖快等优点，在生长时消耗肠道内的氧气，降低氧含量形成相对厌氧环境，有利于厌氧型细菌的生长，如乳酸菌和双歧杆菌，使得肠道内乳酸菌和双歧杆菌等有益菌的数量高于对照组，进一步优化了肠道内的菌群结构，抑制了致病性大肠杆菌等需氧菌的数量。正常微生物群有序地定植于黏膜或细胞上皮形成膜状屏障物，而有害菌只有定植于黏膜上皮的某些位点，才能对机体发挥毒性作用，益生菌能够与致病菌竞争黏膜上皮位点，一定程度上阻止病原菌附着。粪肠球菌和枯草芽孢杆菌具有竞争性的抑制致病菌附着的能力。从而降低了鸡盲肠内大肠杆菌在肠道定植或移位至小肠的数量，有效保护肉鸡肠道健康。

　　4 结论

　　粪肠球菌和枯草芽孢杆菌在体外可抑制禽大肠杆菌的生长，在体内可以提高机体抗氧化能力，改善盲肠微生物区系，从而抑制盲肠内大肠杆菌的数量。综上粪肠球菌和枯草芽孢杆菌可有效抑制禽源大肠杆菌的生长，作为益生菌制剂可用于肉鸡养殖。

　　参考文献：略。