断奶仔猪日粮添加人工甜味剂提高钠/葡萄糖共转运载体的表达-中国饲料行业信息网-立足饲料，服务畜牧

　　1方法

　　1.1 猪,日粮和组织样品采集

　　将28日龄的长白×大白哺乳仔猪雌雄配对置于标准猪圈中(1.5m×1.5m，26.7℃/80℉恒温，12ｈ照明和黑暗轮换)。使用除尘锯末防止垫料混入饲料中。将试验猪断奶并饲喂如下等能日粮（15.75 MJ/kg）3天：试验组1，16头仔猪饲喂商业生产模式的小麦豆粕日粮（Target Feeds Limited，Whitchurch，UK），含有43％的可消化CHO；试验组2，12头仔猪饲喂相同的基础日粮，但添加了Sucram（150 mg/kg饲料），其中含有人工甜味剂组分糖精钠120 mg/kg饲料，NHDC 30 mg/kg饲料；试验组3，8头仔猪，饲喂43％CHO，但是糖精钠和NHDC添加于饮水中，并使得最终摄入的量和实验组2一致；试验组4，8头仔猪饲喂日粮含有43％CHO，糖精钠的浓度为0.25 mM，最终糖精钠的摄入量为34.8 mg/天/头；试验组5，8头仔猪饲喂日粮含有43％CHO，NHDC的浓度为0.02 mM，最终NHDC的摄入量为8.7 mg/天/头；试验组6，4头仔猪饲喂基础日粮，添加Sucram和Lactisole（人甜味味觉受体特异的抑制剂），Lactisole通过饮水添加（11）。以上试验动物整个试验期间均保持健康状态，未出现肠道紊乱的症状。试验进行3天后，向仔猪的颅静脉腔注射20 ml戊巴比妥（200 mg/ml Pentoject，Animal Care Limited，Dunnington，York，UK）处死仔猪（遵循英国Home Office Schedule 1 regulation）。立即从小肠近端（胃幽门口远端），中段（小肠中段的位置）及远端（回盲肠接合处的近端）分别切除约40 cm的长度。将所取肠段外翻，用冰的盐水漂洗后用铝箔包裹，置于液氮冻存。待返回实验室后将所取组织样品储存于-80℃，直至使用时取出。

　　1.2刷状缘膜囊的分离

　　根据Shirazi-Beechey等（12）描述的方法分离刷状缘膜囊。确保所有操作均在4℃条件下执行，该操作步骤也与以前研究所描述的方法一致(13。

　　1.3 转运研究

　　葡萄糖转运的测定是根据Dyer 等（14）所描述的方法进行的，该方法是基于Shirazi-Beechey等（12）所述方法演变而来。刷状缘膜囊泡（100μｇ）在38℃孵育1分钟。反应起始添加100μl孵育培养基，包括100 mM-NaSCN(或者KSCN)，100 mM-甘露醇，20 mM-HEPES/Tris(PH7.4)，0.1 mM MgSO4，0.02% (w/v) NaN3和0.1 mM-[U-14C]-D-葡萄糖。3s后添加1ml冰冷的终止缓冲液终止反应，缓冲液包括150 mM-KCl，20 Mm-HEPES/Tris (pH 7.4)，0.1 mM MgSO4，0.02%(w/v) NaN3和0.1 mM-根皮苷。取0.9ml溶液迅速在0.22 μm孔径的醋酸/硝酸纤维素滤膜上（GSTF02500，Millipore，Watford，Herts，UK）过滤。用1ml冰冷的终止缓冲液分别冲洗5次滤膜，用液体闪烁计数的方法测定保留在滤膜上的放射性。所有的摄入测定重复三次。

　　1.4 蛋白质免疫印迹法

　　根据以往Dyer等（15，16）所描述的方法操作。使用SGLT1（客户合成）抗体和β-actin(15-17)(克隆AC-15；Sigma-Aldrich Ltd，Poole，Dorset，UK)。二抗上交联辣根过氧化物酶（DAKO Limited，Ely，Cambridge，UK）以使得免疫反应条带可视且化学发光度得以提高（GE Healthcare，Little Chalfont，Bucks，UK）。使用Phoretix 1D软件（Nor-linear Dynamics，Newcastle-upon-Tyne，UK）扫描免疫反应条带的光密度并进行定量。

　　1.5 定量PCR

　　将SGLT1（登录号：M34044；正向5＇-AAAGGAGAGGTCTGGGATGGTAA-3＇，反向 5＇-ATTTCCCTAGTGGCCTGAGATTG -3＇）和β-actin（登录号：DQ452569;正向 5＇-CGAGGCCCAGAGCAAGAG-3＇，反向 5＇-TCCATGTCGTCCCAGTTGGT -3＇）的PCR扩增进行定量。依照之前提到的方法（16）从组织分离RNA，互补DNA的合成并进行定量PCR。SGLT1所有的反应都在Rotor-Gene 3000（Qiagen Limited，Crawley，West Sussex，UK）定量PCR仪上测定，每样本设3个重复，并且均与β-actin的表达丰度对比以获得SGLT1的相对表达丰度值。

　　1.6 免疫组化法对味觉受体蛋白和肠道激素进行定位

　　用安乐死的方法处死试验动物之后立即将小肠近端，中段和远端的组织在4%（w/v）的多聚甲醛PBS溶液中固定4小时。随后放入20%（w/v）的蔗糖（Fluka，Gillingham，UK）PBS溶液中。然后将组织样本用凝胶包埋并在液氮中冷却的异戊烷中冷冻，直至切片前将其取出至于恒温冷冻切片机（Bright，Huntingdon，Cambs，UK）内。融解固定在多聚赖氨酸包被玻片上的10μm厚的连续切片，用特异性抗体封闭液在室温下封闭非特异性连接位点1小时，然后PBS冲洗5×5min。T1R2，T1R3和味导素抗体的特异性封闭液包含5%（w/v）的蔗糖，3%（w/v）的牛血清白蛋白，2%（v/v）的驴血清和0.1%（w/v）的NaN3 PBS缓冲液。当使用GLP-1，GLP-2，GIP或5－羟色胺的抗体时，封闭液包括3%（w/v）的牛血清白蛋白，2%（v/v）的驴血清和0.1%（w/v）的NaN3 PBS缓冲液，当使用SGLT1抗体和嗜铬粒蛋白A抗体时，封闭液包括10%（v/v）的驴血清PBS缓冲液。

　　不同物种产生的一抗均被用来做单一的或双向的免疫标记，它们包括嗜铬粒蛋白A（ab8205）的多克隆抗体和5－羟色胺（ab3439）多克隆抗体以及抗人嗜铬粒蛋白A（ab8204）的单克隆抗体均是兔源的。这些抗体购于Abcam 有限公司（Cambridge，UK），并以1：100的比例稀释。兔源SGLT1（通常合成）抗体是把SGLT1第402－420位氨基酸（STLFTMDIYTKIRKKASEK，）的合成肽作为抗原，该段序列是一段保守的内环结构序列，与猪的SGLT1序列具有93.1%的同源性，次抗体使用时按照1：100的比例进行稀释使用，该抗体也在蛋白质印迹检测时使用（见文章前部分）。抗T1R2（H-90）和T1R3（H-145）的抗体由山羊来产生，购自Santa Cruz 生物公司(Calne，UK)，以1：750的比例稀释使用。α-味导素抗体（R.F.Margolskee教授馈赠，Monell Chemical Senses Center，Philadelphia，PA，USA），是兔源的抗体，按照1：300的比例稀释使用。山羊抗GIP（Y20）和GLP-1（C-17）以及GLP-2（C-20）抗体使用时按照1：100的比例稀释，购自Santa Cruz 生物公司。

　　如果要进行二次蛋白质免疫印迹检测时，不同种属产生的一抗在4℃孵育过夜，几种抗体混合时不会改变每种所要求使用的终浓度。抗体孵育后用PBS冲洗载玻片，并用荧光染料标记的抗体染切片。结合Cy3-或荧光异硫氰酸酯的IgG二抗（Stratech Scientific Limited，Suffolk，UK）以1：500的比例稀释，在室温下孵育1小时。同上PBS仔细冲洗切片，用Vectashield Hard固定培养基（Vector Laboratories Limited，Peterborough，UK）固定。落射荧光显微镜（Nikon，Kingston upon Thames，Surrey，UK）扫描切片，并用Hamamatsu数码相机（C4742-96-12G04，Hamamatsu Photonics K.K., Hamamatsu City，Japan）捕捉图像。用Imaging Products Laboratory 影像软件（Nikon）将连续切片的图像进行合并。

　　1.7 Na+/葡萄糖共转运蛋白1的免疫荧光定量分析

　　使用Imaging Products Laboratory 软件（Nikon）抓拍免疫荧光图像，储存为16-位的Tiff 文件。再利用MetaMorph（MDS Analytical Technologies Limited,Workingham，Berks，UK）软件进行定量分析，具体方法参考前述论文(13)。

　　1.8 统计分析

　　用带有标准误的平均数来表示测定结果，非配对双尾t检验（GraphPad Prism 5； Graphpad Software，Inc., La Jolla，CA，USA）分析数据。P＜0.05结果差异显着。

　　1.9 伦理学证明

　　本试验遵循了国家关于动物福利和使用的指导条例来进行操作，所有实验都是在利物浦大学伦理委员会的监督下完成的。