断奶仔猪日粮添加人工甜味剂提高钠/葡萄糖共转运载体的表达-中国饲料行业信息网-立足饲料，服务畜牧

　　2.2 饲料中添加人工甜味剂Sucram对Na+/葡萄糖共转运蛋白1表达的作用

　　已证实猪肠道表达甜味受体，本研究目的在于确定饲喂人工甜味剂后SGLT1表达的效果如何（图4）。饲喂含43%的CHO并添加Sucram的商业猪日粮的仔猪，与饲喂不含Sucram猪日粮仔猪的肠道相比（图4（a），小肠中段SGLT1 mRNA表达增长2倍多（P=0.001），校正的SGLT1蛋白（图4（c）和（d））表达量增长1.6倍（P=0.0195），Na+ -依赖型葡萄糖转运的初速度提高1.8倍（P=0.002）（图4（b））；这些数据均是在相同的刷状缘膜囊泡群体中测定的。同样饲喂含43%的CHO，添加和不添加Sucram的商业猪日粮的仔猪的Na+ -依赖型D-型葡萄糖的摄取速率分别为358.7（SEM 34）和204.7（SEM 18.6）pmol/s/mg蛋白（图4（b））。饲喂加或不加Sucram的任何一种日粮，仔猪肠道中绒毛的高度和隐窝的深度都没有变化（数据未显示）。饲喂含Sucram的仔猪肠道近端SGLT1的表达量会上升，而远端则没有变化（数据未显示）。

　　图4. 饲喂人工甜味剂，Sucram（43S），糖精钠（43Sa），新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC，43N）或糖精钠和NHDC（43SaN）对猪小肠中段Na+/葡萄糖共转运蛋白1（SGLT1）表达的影响。（a）SGLT1 mRNA相对于内参β-actin 的表达相对丰度的稳恒水平（b）刷状缘膜囊泡（BBMV）对Na+依赖-D-型葡萄糖摄取的初始速率。（c）BBMV中SGLT1和内参β-actin对比的蛋白质免疫印迹分析。（d）光密度法分析SGLT1和β-actin蛋白质免疫印迹图的相对表达丰度。N为6-12只动物，每组数据重复三次。结果用平均数和标准误表示。*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001时平均值差异显着(非配对t检验)。

　　已有研究证实当仔猪饲喂含Sucram的日粮时SGLT1的表达量上调，接下来要研究甜味剂的组分，即糖精和NHDC单独或者共同添加到仔猪饮用水中的效果。研究目的：（i）Sucram添加到饮用水中和添加到固体饲料中是否有相同的效果；（ii）确定每种甜味剂促使表达上调的作用大小。

　　为确保饮用水中甜味剂的浓度和饲料中的含量相当，首先精确地测定每天进食的饲料和水的量：每只动物（n＝60仔猪）每天分别进食0.290（SD 0.127）kg饲料和0.688（SD 0.26）升水。根据添加Sucram饲料中的糖精钠和NHDC含量分别为120mg/kg和 30mg/kg，因此我们确定饮用水中糖精钠和NHDC各自浓度分别为0.25 mM和0.02 mM。每只仔猪每天从饮用水中分别摄食糖精钠，NHDC（分别含有），糖精钠和NHDC（共同含有）这几种甜味剂的平均量为41.19（SD 2.86）mg，8.05（SD 4.33）mg和41.73（SD 5.97）mg及5.80（SD 1.09）mg。

　　饲喂含43%的CHO商品日粮时，当（a）糖精钠+ NHDC，（b）糖精钠或（c）NHDC任意一种添加到仔猪饮用水中，与饮用不含甜味剂饮用水相比，测定仔猪肠道SGLT1表达量都会有相似的增加（图4）。分别摄入糖精钠+ NHDC，糖精钠和NHDC仔猪的小肠中段SGLT1 mRNA表达量分别升高2倍（P=0.001），1.8倍（P=0.003）和1.6倍（P=0.016）（图4（a））。这三种日粮采食方式SGLT1蛋白含量相应地提高1.6倍（P=0.035），1.9倍（P=0.037），1.8倍（P=0.040）（图4（c）和(d)），同时葡萄糖转运量也相对提高（图4（b）），D-型葡萄糖摄取的初速度分别为284.4（SEM 17），289.5（SEM 19.9）和305.8（SEM 14.5）pmol/s/mg蛋白（图4（b））

　　2.3 沿着隐窝绒毛轴Na+/葡萄糖共转运载体蛋白1的免疫荧光定量

　　分别在饲喂含43%CHO并添加Sucram的商品猪日粮与不添加Sucram的同样日粮，或者饮用水中添加糖精钠及NHDC的情况下，用定量免疫荧光法检测沿着隐窝绒毛轴Na+/葡萄糖共转运载体蛋白1的表达量。结果表明饲料中添加Sucram或者饮用水中添加甜味剂，与仅仅饲喂商品日粮的对照组比较，沿着隐窝绒毛轴的中部，上部和下部区域SGLT1表达量平均提高1.4倍，1.3倍和1.2倍。在小肠近端区域也能观察到SGLT1表达量的增加，远端却没有（数据未展示）。

　　2.4 Lactisole 对Na+/葡萄糖共转运蛋白1 表达的作用

　　Lactisole是一种芳烷基羧酸，通过结合人T1R3的跨膜区域来抑制人的甜味味觉受体（11）。但它不会抑制小鼠和大鼠对甜味感觉（11，18）。0.073 mM（相当于1.47（SEM 0.3）mg/kg体重）Lactisole连续3天添加到含43%CHO并添加Sucram的仔猪商品日粮中。之后，分别测定SGLT1在肠组织中的mRNA表达，蛋白质表达和功能执行三个方面的情况。

　　当仔猪饲喂43%CHO并添加Sucram的商品日粮时（图5(a)），与饲喂不含Sucram的同样日粮比较，观察到前者SGLT1 mRNA（P=0.015）的表达量明显增高了2倍多，这种增长体现在SGLT1蛋白表达量上（图5(b)）。然而，饲喂Sucram试验组仔猪的饮用水中添加Lactisole并不会抑制SGLT1表达的上调（图5(a)和(b)），表明Lactisole对猪T1R3没有抑制效果。

　　图5. Lactisole是一种人甜味味觉受体的抑制剂，却不能抑制猪肠道甜味剂诱导的Na+/葡萄糖共转运蛋白1（SGLT1）表达的上调。仔猪分别饲喂含43%碳水化合物的商品日粮（43），添加Sucram不含Lactisole的日粮（43Suc），添加Sucram并含有0.073mM Lactisole的日粮(43Suc+lac)。（a）以β-actin mRNA作为内参进行PCR定量测定，确保SGLT1 mRNA在稳恒的表达水平。蛋白质免疫印迹法检测从小肠中段分离出的刷状缘膜囊泡提取的SGLT1蛋白和β-actin蛋白（见上图）。光密度分析（（b）,下图）和内参基因表达对比的SGLT1表达蛋白质免疫印迹测定结果（n 4-12只动物）。结果用平均数和标准误共同表示。*P＜0.05, ***P＜0.001时平均值差异显着(非配对t检验。

　图6. 人，小鼠和猪甜味味觉受体亚基T1R3的氨基酸序列比对结果。比对分析采用Vector NT1（Invitrogen，Paisley，UK）进行。与小鼠和猪相比，人特异性Lactisole抑制作用起关键作用的残基标注为红色。新橙皮苷二氢查耳酮所激活的重要氨基酸残基被标注为绿色。