摘要: 为研究乳酸菌体外对大肠杆菌的拮抗作用, 将3 株乳酸菌与2株大肠杆菌体外分别共培养观察拮抗情况。结果显示, 等量同时间接种, 96h内乳杆菌就将大肠杆菌全部抑杀; 乳酸菌比大肠杆菌早24 h 接种, 72 h内将大肠杆菌全部抑杀; 大肠杆菌比乳酸菌早24 h 接种, 在120 h 内也可全部被抑杀。3 株乳酸菌按一定比例复合, 会使拮抗的效果增强。

　　关键词: 微生态、中药、益生素、发酵、乳酸杆菌; 大肠杆菌; 拮抗作用

　　畜禽大肠杆菌病是畜牧业生产中常见传染病之一, 对集约化养殖业危害极大。生产上由于大肠杆菌耐药情况非常严重,给临床治疗此病带来困难 。乳酸杆菌是畜禽肠道内主要的正常菌群, 具有抗感染、免疫刺激等许多生理功能。本试验研究3株乳酸菌体外对大肠杆菌的拮抗作用, 以期为乳酸菌用于预防治疗大肠杆菌病提供理论依据。

　　1   材料与方法

　　1.1 试验材料

　　菌种: 乳酸乳杆菌( Lactobacillus lactis, L.l)、嗜酸乳杆菌( Lactobacillus acidophilus, L.a )、乳酸链球菌( Strep toccuelactis, S.l) 分离自健康鸡肠道; 大肠杆菌1701株由发病鸡场分离得到; 大肠杆菌TM 128株由江苏省农业科学院惠赠。

　　培养基: 改良MRS液体培养基、普通琼脂培养基、普通肉汤培养基。

　　1.2 试验方法

　　将乳酸乳杆菌、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌分别在各自适宜的培养基内繁殖, 传1代。取20 h培养物, 调整菌的浓度为10^7 CFU /mL。

　　取含改良MRS液体培养基试管4 支, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50 :2) 100uL, 同时再分别接种大肠杆菌1701或TM 128各100 uL; 设大肠杆菌单独培养管作对照, 置恒温培养箱37 培养。取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板, 检查大肠杆菌存活情况, 记录含活菌数。

　　取含改良MRS液体培养基试管4 支, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50: 2) 100 uL, 37 培养24 h后, 分别接种大肠杆菌各100 uL, 置恒温培养箱37 再培养; 取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板, 检查拮抗情况。

　　取含改良MRS液体培养基试管4支, 接种大肠杆菌各100 uL, 37 培养24 h后, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50:2) 100 uL, 37 ℃再培养; 取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板,检查拮抗情况。

　　分别取上述各时间点培养物0.5 mL, 用灭菌生理盐水做连续稀释( 10^-1－ 10^-10 ) 后, 用滴注法点种于事先制作并烘

　　干表面水分的普通琼脂平板上, 每滴100 uL, 每个稀释度平

　　行3滴。经37℃ 24 h培养后分别计数大肠杆菌菌落数。

　　2   结果

　　( 1) 乳酸菌和大肠杆菌同时接种, 乳酸菌对大肠杆菌的拮抗作用结果见图1和图2。

　　　　图2 同时接种乳酸菌对大肠杆菌TM 128拮抗结果

　　由图1、2可以看出, 无论是试验组还是对照组, 1701株与TM 128在前24 h都处于增殖期, 试验组在24 h后, 细菌数开始下降, 而对照组, 则在48 h后, 开始出现下降, 但是试验组明显下降的更快。乳酸菌和大肠杆菌培养96 h后, 大肠杆菌全部被抑杀, 对照组培养120 h后, 大肠杆菌仍有存活。复合菌表现出比单一菌更强的拮抗能力。

　　( 2) 乳酸菌培养24 h 后接种大肠杆菌, 乳酸菌对大肠杆

　　菌的拮抗作用结果见图3和图4。

　　图4 乳酸菌培养24 h后接种大肠杆菌TM 128的拮抗结果

　　结果表明, 当乳酸菌先培养24 h, 然后接种大肠杆菌共培养时无论是试验组还是对照组在前24 h,大肠杆菌仍然处于增殖期, 但是试验组大肠杆菌的增殖幅度明显小于同时间等量接种结果, 说明了乳酸菌提前接种具有良好的拮抗效果。

　　( 3) 大肠杆菌先培养24 h后, 再接种乳酸菌对大肠杆菌的拮抗作用见图5和图6.

　　　图6 大肠杆菌TM 128培养24 h后接种乳酸菌的拮抗结果

　　图5、6可以看出, 当大肠杆菌先培养24 h, 然后接种乳酸菌共培养48 h后, 大肠杆菌的仍得到很好的抑制, 120 h后, 大肠杆菌可以完全被抑杀。

　　3 结论与讨论

　　本试验中, 3株乳酸菌对大肠杆菌1701、TM 128 株的生长增殖的拮抗作用, 均显示了抑制效果。所得的结果可归纳为以下几点:

　　①无论是禽致病性大肠杆菌1701, 还是猪致病性大肠杆菌TM 128, 在与包括L.a、L.l和S.l在内的乳酸菌混合培养时, 大肠杆菌的生长增殖均受到抑制, S.l对大肠杆菌的抑制效果最为明显。这可能与S.l的生长增殖速度较其它两株菌快有关, 生长增殖速度越快其培养基pH 下降速度越快, 培养基的pH 降低越明显, 则抑制效果越强, 只是在抑制时间上有差异,这可能与所用菌株的生长增殖速度有关。

　　②复合乳酸菌在拮抗效果上优于单一菌株, 说明某些菌种复合可以形成较强的微生态制剂。机理不明, 可能因为不同菌株在生长增殖过程中起到了相互促进增殖的作用; 或者由于其中的某一菌株可以促进另一菌株产生抗菌素一类的物质。

　　③不管是同时接种还是先后不同时间接种, 乳酸菌对大肠杆菌均有一定的抑制效果。但明显乳酸菌提前24 h 接种的效果要好的多, 主要由于乳酸菌经过24 h的培养, 在局部形成了优势微生物菌群, 可以很好的抑制大肠杆菌的生长增殖;而大肠杆菌提前24 h接种, 仍具有一定的拮抗效果, 只是拮抗的时间要到120 h。