摘要

　　核因子NF-κB 是一种多变的转录因子，其激活会导致炎症、病毒复制和生长调节。由于其在发病机制中的作用，NF-κB 被认为是药物开发的一个关键目标。在本报告中，我们表明，血根碱（一种异喹啉类生物碱），是一种已知的抗炎剂，也是NF-κB 激活通路的一种有效抑制剂。用肿瘤坏死因子处理骨髓ML-1a细胞可迅速激活NF-κB ，这种激活以剂量和时间依赖的方式被血根碱完全抑制。血根碱（Sanguinarine）没有抑制NF-κB 蛋白与DNA的结合，而是抑制了导致NF-κB 激活的代谢途径。还原剂逆转了激活过程，表明一个关键的巯基参与了NF-κB 的激活。血根碱（Sanguinarine）阻断了肿瘤坏死因子诱导的IB（NF-κB 的一个抑制性亚分子单位）的磷酸化和降解，并抑制了p65亚单位向细胞核的转位。由于血根碱还抑制了白细胞介素-1、山梨醇和软海绵酸诱导的NF-κB 的激活通路，但没有抑制过氧化氢或神经酰胺的激活通路，因此导致NF-κB 激活的生化途径可能对不同的诱导剂是不同的。总的来说，我们的结果表明，血根碱是NF-κB 激活的有效抑制剂，并发现它在I-kBa磷酸化之前的一个步骤发挥抑制作用。

　　介绍

　　血根碱（是一种苯丙菲啶生物碱）来源于美洲红血蒽和亚洲博落回植物（参考文献见参考文献1）。这种苯丙菲啶生物碱是白屈菜碱的结构是同系物，是蛋白激酶C的有效抑制剂（2）。血根碱已被证明在动物中具有抗肿瘤（3）和抗炎特性（4），并抑制中性粒细胞功能，包括体外脱颗粒和吞噬作用（5）。它也是Na-K钠钾泵依赖性ATP酶（6-8）和胆碱酶（9）的有效抑制剂。

　　NF-κB 是一种核转录因子，存在于其易位到细胞核的过程中（有关参考文献，请参阅参考文献10）。用各种炎症和应激刺激处理细胞，包括脂多糖、肿瘤坏死因子 （TNF）、1 白介素 （IL）-1、神经酰胺、过氧化氢、紫外线、佛波肉豆蔻酸酯 （PMA） 和冈田酸 （OA） 激活转录因子。NF-ΚB  是一种普遍存在的转录因子，可调节各种细胞因子、其受体、主要组织相容性复合物基因、细胞粘附蛋白以及参与炎症、感染性休克、动脉粥样硬化、细胞增殖和病毒复制的其他基因产物（包括人类免疫缺陷病毒-1）的表达。

　　血根碱表现出抗菌，抗炎和抗氧化特性（5，11，12，13，14，15，16，17）。由于抗炎化合物如阿司匹林和糖皮质激素已被证明抑制NF-κB（的活化18，19，20），我们研究了血根碱对包括TNF在内的多种药物诱导的NF-κB活化的影响。结果表明，血根碱是NF-κB活化的有效抑制剂，可阻断IκBα的磷酸化和降解，因此表明血根碱是干预NF-κB依赖性病理反应的潜在候选者。

　　实验程序

　　材料

　　ATRIX Laboratories Inc.（科罗拉多州柯林斯堡）的Ken Godowski博士提供了高度纯化的血根碱制剂。OA是从LC实验室（马萨诸塞州沃本）获得的。Ouabain和氯化白屈菜碱是从Research Biochemical International（马萨诸塞州Natick）获得的。神经酰胺（C2）是从Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）获得的。小檗碱、牛血清白蛋白和PMA是从Sigma获得的。[γ-32页]从ICN（加利福尼亚州科斯塔梅萨）获得比活性为7000 Ci/mmol的ATP。细菌来源的重组人TNF，纯化至均一，比活性为5×107单位/mg，IL-1由Genentech，Inc.（南旧金山，加利福尼亚州）提供。青霉素、链霉素、RPMI 1640 培养基和胎牛血清均来自 Life Technologies， Inc.（纽约州格兰德岛）。从圣克鲁斯生物技术公司（加利福尼亚州圣克鲁斯）获得针对IκBα，细胞周期蛋白D1，NF-κB亚基p50和p65以及c-Rel的抗体。

　　细胞株系

　　组织细胞性淋巴瘤 （U937）、骨髓 （ML-1a）、正常人包皮成纤维细胞 （FS4） 和 T （Jurkat） 细胞常规生长在补充有谷氨酰胺 （2 mm）、庆大霉素 （50 μg/ml） 和胎牛血清 （10%） 的 RPMI 1640 培养基中。将细胞以1×105cells/ ml的密度接种在含有10ml培养基的T25烧瓶（Falcon 3013，Becton Dickinson Labware，林肯公园，新泽西州）中，并在37°C的95%空气和5%CO 2气氛中生长。 当细胞密度达到1-2×106 / ml时，将培养物分开。

　　电泳迁移率测定 （EMSA）

　　EMSA如前所述详细（21，22）进行。简而言之，在不同处理后从2×106细胞制备核提取物（NE），然后立即使用或储存在-70°C。 EMSA通过在37°C下将4μgNE与8fmol的32P端标记的45-mer双链寡核苷酸孵育15分钟来进行，该双链寡核苷酸含有来自人类免疫缺陷病毒长末端重复序列的NF-κB结合位点（5′-TTGTTACAA GGGACTTTC CGCTG GGGACTTTC CAGGGAGGCGTGG-3′）。在5%天然聚丙烯酰胺凝胶上将形成的DNA-蛋白质复合物从游离寡核苷酸中分离出来，然后将凝胶干燥。使用具有突变的NF-κB位点（5′-TTGTTACAA CTCACTTTC CGCTG CTCACTTTC CAGGGAGGCGTGG-3′）的双链寡核苷酸来检查NF-κB与DNA结合的特异性。结合的特异性也通过与未标记的寡核苷酸竞争来检查。对于超移位测定，在用EMSA分析复合物之前，将TNF处理的细胞制备的NE与针对NF-κB的p50或p65亚基的抗体在37°C下孵育30分钟。细胞周期蛋白D1抗体作为阴性对照被纳入对比。

　　IκBα 和 p65 的蛋白质印迹

　　蛋白质印迹基本上如前所述进行（23）。简而言之，来自处理细胞的细胞质提取物在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离IκBα。为了确定p65水平，在9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离NE和细胞质提取物，电转移到Immobilon P膜上，用兔多克隆抗体检测p65，并通过化学发光（ECL-Amersham）检测。

　　结果

　　血根碱及其类似物的结构如图1所示。白屈菜红素是血根碱的近同系物，是蛋白激酶C的特异性抑制剂（2）。小檗碱和血根碱都与DNA相互作用（24）。我们对这些药物的测试表明，在我们使用的条件下，它们对台盼蓝排除确定的细胞活力没有影响（数据未显示）。

　　图2A，对血根碱抑制TNF诱导的NF-κB活化的剂量反应。将ML-1a细胞（2×106 / ml）在37°C下用指定浓度的血根碱预孵育30分钟，然后在有或没有10pm TNF的情况下预孵育30分钟。制备核提取物，并通过EMSA测定NF-κB，如“实验程序”中所述。B，血根碱对TNF诱导的NF-κB活化动力学的影响。将ML-1a细胞（2×106 / ml）在37°C下预孵育30分钟，有或没有5μm血根碱，然后用TNF（10pm）处理指定的时间段。制备核提取物并如上所述测定NF-κB。C，血根碱细胞孵育前、共孵育和孵育后对TNF诱导的NF-κB的影响。ML-1a细胞（2×106 / ml）在37°C下与5μm血根碱在指定的时间孵育，然后在10pm TNF存在下测试NF-κB的活化30分钟。 - 在加入TNF之前存在的血根碱;0、血根碱与TNF重合;+，TNF后添加血根碱。

　　为了进一步了解抑制动力学，我们将细胞与血根碱预孵育30、15和5分钟，然后将它们暴露于TNF。在TNF后0分钟和5，15和30分钟同时加入血根碱。在每种情况下，TNF存在30分钟。如图所示。2 C，用血根碱和TNF孵育细胞在阻断NF-κB活化方面与预孵育一样有效。血根碱也可以阻断，尽管只是部分，即使在TNF后5分钟加入NF-κB活化。在TNF后10分钟或更晚添加时没有效果。

　　我们实验室先前的研究表明，高浓度的TNF（10nm）诱导NF-κB的更强大和快速（5分钟内）活化（22）。为了确定血根碱是否也可以抑制对TNF的强烈反应，将血根碱预处理的细胞用增加浓度的TNF（高达10nm）激发30分钟，然后检查NF-κB（图3A）。尽管 10 nm TNF 对 NF-κB 的活化非常强，但血根碱对它的抑制与 0.01 nm 浓度一样有效。这些结果表明，血根碱是一种非常有效的NF-κB活化抑制剂。

　　图3. A，血根碱对高剂量TNF诱导的NF-κB活化的影响。

　　将ML-1a细胞（2×106 / ml）在37°C下预孵育30分钟，有或没有5μm血根碱，然后用指定浓度的TNF处理30分钟。制备核提取物并测定NF-κB。B，TNF诱导的NF-κB激活的超移位和特异性。从TNF（10pm）激活的ML-1a细胞制备核提取物，与抗体或冷野生型NF-κB寡核苷酸（25倍摩尔过量）孵育15分钟，然后如上所述测定NF-κB。*，EMSA是在存在32P标记的突变寡核苷酸的情况下进行的，其中NF-κB结合位点中的三个G突变为CTC。C，血根碱对NF-κB与DNA结合的影响。将TNF（10pm）激活的ML-1a细胞制备的核提取物与指定浓度的血根碱孵育20分钟，并分析NF-κB活化。

　　由于NF-κB是一个蛋白质家族，因此Rel/NF-κB蛋白的各种组合可以构成与DNA中特定序列结合的活性NF-κB异二聚体（10）。为了证明EMSA在TNF处理的细胞中观察到的迟滞条带确实是NF-κB，我们将TNF活化细胞的NE与p50（NF-κB1）或p65（Rel A）亚基的抗体孵育，然后进行EMSA。针对任一亚基的抗体将条带完全转移到更高的分子量（图3 B）。针对c-Rel或无关抗体的抗体（如细胞周期蛋白D1抗体）不会移动NF-κB条带，因此表明TNF激活的复合物由p50和p65亚基组成。如EMSA上的条带所示，TNF对NF-κB的激活非常具有特异性，因为当添加未标记的寡核苷酸时，条带消失了。当我们使用突变寡核苷酸时，也没有发生结合，其中CTC在NF-κB结合位点被GGG取代（图3 B）。

　　血根碱不干扰NF-κB与DNA的结合

　　已经表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂TPCK和蛋白质酪氨酸激酶抑制剂herbimycin A通过对NF-κB亚基的化学修饰下调NF-κB，从而防止其与DNA的结合（25，26）。为了确定血根碱是否也修饰NF-κB蛋白，我们将由TNF活化细胞制备的NE与不同浓度的血根碱体外孵育。EMSA（图3 C）表明，浓度高达100μm的血根碱不会改变NF-κB与DNA结合的能力。

　　血根碱对NF-κB抑制非特异性细胞类型

　　我们还研究了血根碱阻断TNF诱导的NF-κB活化在另一个骨髓系（U937）和淋巴（Jurkat）和二倍体成纤维细胞（FS4）细胞中的能力。这些实验的结果（图4）表明血根碱抑制所有三种细胞类型的NF-κB。用5μm血根碱观察到几乎完全的抑制，因此表明血根碱的这种作用不是细胞类型特异性的。有趣的是，在特异性结合NF-κB位点的Jurkat细胞中观察到强的组成带，如未标记寡核苷酸摩尔过量25倍的结合所显示的那样。血根碱不抑制该条带的形成，表明血根碱仅抑制TNF诱导形式的NF-κB（p50-p65异二聚体）。通过超移位分析确定的Jurkat细胞中该组成带的组成被发现完全是p50同源二聚体（数据未显示）。

　　血根碱对TNF介导的NF-κB活化的抑制不是通过抑制Na / K-ATP酶

　　一些报告表明血根碱可以抑制Na / K-ATP酶（6，7，8）。为了确定血根碱是否通过抑制这种ATP酶来阻断NF-κB活化，我们测试了瓦巴因（一种众所周知的，有效的Na / K-ATP酶抑制剂（27，28）阻断TNF诱导的NF-κB活化的能力。瓦巴林对TNF诱导的该转录因子的激活没有影响（图5，上图）。因此，血根碱似乎通过其他机制阻断NF-κB活化。

　　图4.血根碱对不同细胞类型中TNF诱导的NF-ΚB 的影响。

　　U937，Jurkat或FS4细胞（2×106 / ml）预孵育30分钟，有或没有5μm血根碱，然后TNF（10pm）30分钟。制备并测试核提取物的NF-κB活化，如“实验程序”中所述。通过在存在25倍摩尔过量的冷NF-κB寡核苷酸的情况下进行EMSA来确定NF-κB结合的特异性。

　　血根碱的结构类似物不抑制NF-κB活化

　　如图所示。1、白屈菜红碱和小檗碱与血根碱有很强的结构相似性。因此，我们研究了它们阻断NF-κB活化的能力。如图所示。5，白屈黄碱（中图）和小檗碱（下图）均未对TNF诱导的NF-κB活化有任何影响。由于已知白屈菜红碱抑制蛋白激酶 C （2） 并且小檗碱通过与 DNA 结合介导其作用 （24），结果表明血根碱不会通过这两种机制中的任何一种阻断 NF-κB 活化。

　　血根碱阻断 OA、PMA、神经酰胺、H2O2 和 IL-1 的 NF-κB 活化

　　除TNF外，NF-κB还被多种其他试剂激活，包括OA，PMA，神经酰胺-C2，H2O2和IL-1。然而，这些药物的激活机制是否与TNF的激活机制相同尚不清楚。因此，我们研究了血根碱阻断不同药物诱导的NF-κB活化的能力。如图6所示，血根碱完全阻断了PMA、IL-1和OA对NF-κB的活化。有趣的是，它仅部分阻断了神经酰胺的作用，对H2O2诱导的NF-κB活化没有影响。这些结果表明，导致TNF、PMA、IL-1和OA激活NF-κB的途径与神经酰胺和H2O2诱导的途径不同。

　　图 5不同浓度的瓦巴因、氯化白屈菌素和小檗碱对TNF介导的NF-κB活化的影响。

　　还原剂DTT逆转血根碱的抑制作用将U937细胞（2×106 / ml）在37°C下与瓦巴因，白屈菜碱和小檗碱预孵育60分钟，然后在37°C下用TNF（100pm）处理30分钟，然后测试NF-κB活化，如“实验程序”中所述。

　　图 6血根碱对 PMA-、IL-1-、神经酰胺、冈田酸和 H2O2 介导的 NF-κB 活化的影响。

　　将U937细胞（2×106 / ml）在37°C下用血根碱（5μm）预孵育60分钟，然后在37°C下用PMA（100ng / ml），IL-1（200ng / ml），H 2 O 2（1mm）或神经酰胺-C2（10μm）或冈田酸（600nm）处理60分钟，然后按照“实验程序”中所述测试NF-κB活化。

　　苯胂氧化物，N-对甲苯磺酰基-l-苯丙酰氯甲基酮（TPCK），草霉素A和咖啡酸（3，4-二羟基肉桂酸）苯乙酯抑制NF-κB活化的生物学作用可以通过还原剂（逆转25，26，29，30）逆转。此外，血根碱含有亚胺离子，可以与蛋白质的硫醇基团形成假碱（31）。因此，我们研究了DTT逆转血根碱对TNF诱导的NF-κB活化的抑制作用的能力。在存在和不存在DTT的情况下用血根碱处理细胞，然后检查TNF对NF-κB的活化。如图所示。7、DTT本身对TNF依赖性激活NF-κB没有任何影响，但完全逆转了血根碱诱导的抑制作用。这些结果证明了巯基在TNF依赖性NF-κB活化中的关键作用。

　　血根碱含有硫醇反应性亚胺基团，如果NF-κB的硫醇基团已经在NE和EMSA缓冲液中被DTT阻断，血根碱不可能在体外修饰NF-κB蛋白。然而，当NE在无DTT缓冲液中制备时，当EMSA缓冲液中省略DTT时，结果保持不变（数据未显示）。因此，血根碱通过不同于TPCK或草霉素A的机制抑制NF-κB活化。

　　图7.DTT对血根碱诱导的NF-ΚB 活化抑制的影响。

　　ML-1a细胞（2×106 / ml）用DTT（100μm）孵育30分钟，然后有或没有血根碱（5μm）30分钟，然后用TNF（100pm）活化30分钟。如前所述制备并测定核提取物的NF-κB。在标有*的组中，将DTT与血根碱一起加入30分钟。

　　图8血根碱对TNF诱导的IκBα降解动力学以及细胞质和细胞核中p65水平的影响。

　　将A，ML-1a细胞（2×106 / ml）在37°C下预孵育30分钟，有或没有5μmsanguinarine ，然后用TNF（10pm）处理指定的时间。制备核提取物并测定NF-κB（见图2 B），从细胞中制备细胞质提取物，并通过蛋白质印迹分析测定IκBα，如上所述。B，将细胞在37°C下预孵育30分钟，有或没有5μm血根碱，然后用TNF（10pm）处理指定的时间段。制备细胞质和细胞核提取物，并通过蛋白质印迹分析测定p65。

　　血根碱抑制TNF依赖性磷酸化和IκBα的降解

　　磷酸化先于NF-κB易位到细胞核和IκBα的蛋白水解降解（回顾，见参考文献10）。为了确定血根碱是否影响IκBα降解，研究了血根碱影响下TNF激活NF-κB的动力学。制备核提取物和细胞质提取物分别用于EMSA和IκBα蛋白质印迹分析。NF-κB在治疗后10分钟就发生在治疗10分钟，在15至40分钟之间达到峰值，并在60分钟后下降（图2 B）。用血根碱预处理在TNF处理的所有时间点抑制NF-κB活化。

　　由于NF-κB活化还需要NF-κB的p65亚基的核易位，我们通过蛋白质印迹分析检查了p65蛋白的细胞质和核库。如图所示。8 B，TNF诱导的p65在细胞核中的出现被血根碱阻断。这些结果表明，血根碱阻止了IκBα的磷酸化和降解，从而阻止了NF-κB的核易位。

　　图9.血根碱在导致多种药物激活NF-ΚB 的途径中的作用位点。

　　讨论

　　在我们的研究中，血根碱完全阻断了TNF，IL-1，佛波酯和OA诱导的NF-κB的活化，但不能阻断H2O2和神经酰胺激活的NF-κB（图9）。此外，效果不是细胞类型特异性的。白屈菜红碱和小檗碱是血根碱的结构类似物，对NF-κB活化没有影响。血根碱的抑制作用不是由于钠钾Na + / K + - ATP酶的抑制。相反，血根碱阻断了NF-κB的抑制亚基IκBα的磷酸化和降解。

　　血根碱如何抑制NF-κB的活化目前尚不清楚。它迅速进入细胞而不改变膜流动性，并定位在细胞核中（5）。在细胞核中，它与DNA插层，更喜欢富含GC的序列（24，33，34），但这不是它抑制NF-κB活化的方式，就像体外血根碱处理不抑制NF-κB与DNA的结合一样。同样，小檗碱，也已知插入DNA（24），对NF-κB活化没有影响。血根碱也没有直接化学修饰NF-κB。相反，草霉素A和TPCK（25，26），两者都抑制NF-κB活化，可以调节存在于NF-κB蛋白中的RXXRXXC序列（25，35）。

　　一些报告表明血根碱抑制Na / K-ATP酶（6，7，8）。由于 ouabain（一种有效的 Na/K-ATP 酶抑制剂对 TNF 诱导的 NF-κB 活化没有影响），因此血根碱不得通过阻断该 ATP 酶来抑制 NF-κB 活化。

　　我们的结果表明，血根碱通过抑制NF-κB的抑制亚基IκBα的磷酸化和降解来抑制NF-κB活化。两项观察还表明，血根碱靶向NF-κB激活的早期步骤，最有可能是IκB激酶或调节IκB激酶的步骤。1）当与TNF预孵育或重合时，它抑制NF-κB，但在加入TNF后10分钟添加时不抑制NF-κB。2）它只抑制诱导性NF-κB，而不抑制组成型p50同源二聚体。此外，它抑制人包皮成纤维细胞FS4中NF-κB的活化，其中已知诱导性NF-κB通过IκBβ调节（46）。诱导型NF-κB的活化需要丝氨酸32和36处的IκBα磷酸化以及丝氨酸19和23处的IκBβ磷酸化（32）。两种IκB都被假定为被相同的激酶或相似的激酶磷酸化（32）。IκBs 的磷酸化导致 IκBα 中的赖氨酸 21 和 22 以及 IκBβ 中的赖氨酸 22 处的泛素化 （32）。IκBs 的磷酸化导致 IκBα 中的赖氨酸 21 和 22 以及 IκBβ 中的赖氨酸 22 处的泛喹化 （32）。聚泛醇IκB靶向蛋白酶体并迅速降解（37）。抑制磷酸化导致抑制IκB降解。事实上，血根碱抑制IκBα的诱导磷酸化及其随后的降解。

　　蛋白激酶如何被NF-κB活化的诱导剂激活是不确定的，但已经提出从蛋白激酶上游产生活性氧中间体（38，39）。在人外周血中性粒细胞中，血根碱已被证明可以抑制PMA诱导的氧化爆发和超氧阴离子的产生（5，17）。此外，血根碱已被证明对自发氧化具有抗氧化活性（40）。因此，血根碱有可能通过抑制活性氧中间体的生成来抑制NF-κB活化。这与我们的发现一致，即血根碱除了TNF外，还抑制PMA，冈田酸和IL-1诱导的NF-κB活化。然而，有趣的是，血根碱并没有阻断神经酰胺或H2O2诱导的NF-κB活化。这些结果表明，导致不同药物激活NF-κB的信号通路存在差异。

　　最近，推定的IκBα激酶已被证明受泛五醇化调节（41）。血根碱是否可以直接干扰任何这些过程尚不清楚。然而，血根碱具有活性亚胺基团，已被证明与几种蛋白质（31，42，43，44，45）的硫醇基团形成假碱基，包括一些激酶（42）;它很可能修饰IκB磷酸化所需的某些蛋白质的某些反应性硫醇基团。DTT等还原剂与血根碱的亚胺离子形成络合物，从而中和其硫醇反应性（42）。由于用DTT预处理细胞以及DTT和血根碱的孵育消除了血根碱对TNF诱导的NF-κB活化的抑制作用，因此血根碱可能通过直接修饰IκB激酶或激酶上游的其他中间体起作用。这些中间体必须与此处测试的许多炎症因子的活化途径相同（图9）。总体而言，我们提出的结果提供了一种新的机制，通过该机制，血根碱可能表现出其抗炎作用。

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